0 引言
牛乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，含有人體生長(zhǎng)所需求的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是我國(guó)消費(fèi)者的主要飲用乳品。隨著生活水平及健康意識(shí)的提高，消費(fèi)者也越來越重視乳制品的品質(zhì)，普通牛乳已經(jīng)不能滿足消費(fèi)者的需求，市場(chǎng)上相繼出現(xiàn)了羊乳和駱駝乳等特色乳制品。羊乳的平均脂肪粒徑比牛乳小，更容易消化吸收，并且比牛乳的致敏性低。而駱駝乳含有人體膳食所需的必需氨基酸，β-酪蛋白比例高，并含有多種功能性蛋白質(zhì)(如免疫球蛋白、溶菌酶和乳鐵蛋白)。
乳制品經(jīng)過熱處理雖然可以殺死或控制微生物，但也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)。美拉德反應(yīng)又分為初始階段、中期階段和高級(jí)階段，5-羥甲基糠醛和糠氨酸是乳中評(píng)估熱處理是否加工過度的標(biāo)志性產(chǎn)物，其對(duì)人體健康有潛在危害。除此之外，美拉德反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生不同于原料乳的風(fēng)味物質(zhì)。因此，本研究以羊乳和駱駝乳為研究對(duì)象,研究了熱處理過程中美拉德產(chǎn)物的變化規(guī)律。同時(shí)通過電子舌、電子鼻和固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和頂空氣相離子遷移譜對(duì)不同熱處理的羊乳和駱駝乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，為羊乳和駱駝乳的生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。
1 .材料與方法
1.1 材料
1.1.1 樣品的收集
鮮山羊乳是來自山東省濰坊市奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)；鮮駱駝乳樣品采自內(nèi)蒙古阿拉善。將采集后鮮乳隨機(jī)分成3組。以不處理的鮮羊乳和鮮駱駝乳為對(duì)照，對(duì)鮮羊乳和鮮駱駝乳分別通過UHT殺菌機(jī)來制備巴氏殺菌（75℃、15 s）、超巴氏殺菌（120℃、15 s），以及超高溫瞬時(shí)滅菌（羊乳：137℃、4 s，駱駝乳：135℃、5 s）樣品。每個(gè)溫度的波動(dòng)范圍為±2℃。樣品收集后，在-80℃下儲(chǔ)存30 d，完成各指標(biāo)的測(cè)定。
1.1.2 儀器與設(shè)備
電子鼻儀器；電子舌儀器；聯(lián)用儀；超高效液相色譜、色譜柱、色譜柱；UHT殺菌機(jī)。
1.2 方法
1.2.1 糠氨酸含量的測(cè)定
糠氨酸含量的測(cè)定是依據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 13875并作部分改進(jìn)。吸取2.00 mL樣品于耐熱密封管中，再吸取6.00 mL的鹽酸溶液（10.6 mol/L），混勻后在110℃下加熱水解18 h。取出樣品冷卻后過濾，將1 mL濾液與5.00 mL 6 g/L的乙酸銨溶液混勻后過0.22μm水相濾膜，經(jīng)超高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。以含0.1%三氟乙酸的去離子水為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，分析了已知量為25、12.5、6.25、1.25和0.625μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)FRS樣品。所有樣品一式三份的分析。
1.2.2 5-羥甲基糠醛含量的測(cè)定
5-羥甲基糠醛含量的測(cè)定是參照NY/T 1332-2007并作部分改進(jìn)。將10 mL樣品與5 mL 0.15 mol/L草酸溶液混勻，90℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫后再加入10 mL甲醇并搖勻，再分別加入3 mL乙酸鋅和亞鐵氰化鉀，搖勻靜置15 min，再在4℃下以6 000 r/min的速度離心10 min，將上清液經(jīng)兩次過濾后用甲醇定容至50 mL。經(jīng)0.45μm水相濾膜過濾后，經(jīng)超高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。甲醇為流動(dòng)相A，去離子水為流動(dòng)相B，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，洗脫條件為15%:85%甲醇和水。所有樣品都進(jìn)行了一式三份的分析。
1.2.3 電子鼻測(cè)定風(fēng)味
電子鼻風(fēng)味的測(cè)定是參照依勝男等的方法并作部分改進(jìn)。在電子鼻專用瓶中加入2 mL的羊乳和駱駝乳樣品并在室溫條件下平衡30 min，在電子鼻設(shè)備上測(cè)定各樣品間氣味的差異。電子鼻設(shè)備設(shè)置：流速為300 mL/min，載氣是空氣，頂空60 s，延滯180 s。樣品是選取48～50 s較平穩(wěn)的一個(gè)階段進(jìn)行信息的采集。每個(gè)樣品重復(fù)4次，選取其中3個(gè)較好的作為平行。
1.2.4 電子舌測(cè)定風(fēng)味
電子舌風(fēng)味的測(cè)定是參照宋慧敏等的方法并作部分改進(jìn)。將1 mL樣品用去離子水稀釋100倍，過0.45μm水濾膜后，放在電子舌專用燒杯中進(jìn)行樣品的測(cè)定。每個(gè)樣品測(cè)定7次，選取后3次作為平行。所有樣品一式三份的分析。
1.2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定
羊乳的測(cè)定方法（SPME-GC-MS)。在專用瓶中加取2 mL樣品，密封。分析在Agilent 7890B儀器上進(jìn)行，帶有5977A質(zhì)量選擇檢測(cè)器。以氦氣為載氣，恒流1.5 m L/min。固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜儀程序從初始溫度35℃保溫5 min，以5℃/min升溫至140℃，保持2 min，再以10℃/min的速度升溫到250℃保持3 min。進(jìn)樣條件為：直接毛細(xì)管界面溫度280℃，離子源溫度230℃，四極溫度150℃，進(jìn)樣器溫度250℃，兩次進(jìn)樣1μL，脈沖無分流(172.4 kPa空氣，0.5 min)。所有樣品進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
駱駝乳的測(cè)定方法（HS-GC-IMS)。將2 mL樣品置于20 mL頂空樣品瓶中，然后將樣品在500 r/min和80°C下孵育20 min。之后，注入500μL的頂空體積，注射針溫度為85°C。采用裝有色譜柱MXT-5(0.1μm,15 m×0.53 mm）的氣相色譜儀在60°C下分離，氮?dú)猓兌取?/span>99.999%）為載氣，初始載氣流速設(shè)定為2 mL/min。在0～2 min內(nèi)維持在2 mL/min，載氣速度在2～10 min內(nèi)從2 mL/min線性增加到10 m L/min。載氣速度在10～20 min內(nèi)從10 mL/min線性增加到100 mL/min。最后，載氣速度在20～30 min內(nèi)從100 mL/min線性增加到150 mL/min。漂移氣體流速設(shè)置為150 mL/min。柱溫設(shè)定為60°C，一式三份進(jìn)行GC-IMS分析。
1.3 數(shù)據(jù)處理
使用SPSS Statistics 22進(jìn)行顯著性分析；使用O-rigin2018軟件進(jìn)行繪制柱狀圖和雷達(dá)圖；GC-MS和GC-IMS的數(shù)據(jù)采用TBtools軟件進(jìn)行熱圖的繪制。主成分分析（principal component analysis,PCA）使用Win Muster軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理。每個(gè)樣品重復(fù)3次。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同溫度和時(shí)間處理駱駝乳和羊乳樣品中FRS含量的變化規(guī)律
FRS含量與美拉德反應(yīng)程度密切相關(guān)，是美拉德反應(yīng)初級(jí)階段的產(chǎn)物，美拉德反應(yīng)與加熱的溫度和時(shí)間有密切的關(guān)系，加熱溫度越高或加熱時(shí)間越長(zhǎng)，美拉德反應(yīng)的程度會(huì)越劇烈，形成的美拉德產(chǎn)物中FRS含量會(huì)越高。FRS的生成速率受蛋白含量的影響較大，因此，FRS含量的表示單位應(yīng)以蛋白為基礎(chǔ)(mg/100 g蛋白質(zhì))。Mehta等測(cè)得鮮牛乳和巴氏殺菌牛乳幾乎不含任何的FRS，其值<10 mg/100 g蛋白質(zhì)，只有高巴氏殺菌樣品顯示含量約為30 mg/100 g蛋白質(zhì)，而在本實(shí)驗(yàn)中鮮羊乳和鮮駱駝乳中的FRS含量3.69和6.89 mg/100 g。Mendoza等測(cè)得巴氏山羊乳(35.8 mg/100 g蛋白質(zhì))和鮮羊乳(6.8 mg/100 g蛋白質(zhì))以及UHT處理過的山羊乳(154.3 mg/100 g蛋白質(zhì))中的FRS。由圖1中可以看出，巴氏羊乳、超巴氏羊乳和UHT羊乳中FRS含量分別為10.55、67.54和130.22 mg/100 g蛋白質(zhì)，而巴氏駱駝乳、超巴氏駱駝乳和UHT駱駝乳中FRS含量分別為9.14、33.44和52.25 mg/100 g蛋白質(zhì)。鮮羊乳中FRS的含量低于鮮駱駝乳FRS的含量；但是經(jīng)過熱處理后，熱處理羊乳樣品中FRS含量明顯高于熱處理駱駝乳樣品。UHT羊乳和UHT駱駝乳中FRS含量分別是鮮乳的35倍和8倍，出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是由于較高溫度的處理，使乳中糖類和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，加快了美拉德反應(yīng)的進(jìn)程，從而增加FRS的含量。除了在熱處理過程中，FRS含量隨熱處理強(qiáng)度的增大而增加外，在貯藏過程中，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)和溫度升高，FRS含量也持續(xù)增加。
圖1 不同熱處理羊乳和駱駝乳中FRS含量的變化
大寫字母A表示羊乳樣品有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；小寫字母a表示駱駝乳有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；*表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），**表示有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001），下同
2.2 不同溫度和時(shí)間處理駱駝乳和羊乳樣品中5-HMF含量的變化規(guī)律
在酸性環(huán)境下，乳糖與蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生的化合物會(huì)水解形成5-HMF，而且乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，會(huì)加速5-HMF的形成。Haghani-Haghighi等在鮮牛乳和巴氏殺菌牛乳中檢測(cè)不到5-HMF，而Morales等在巴氏殺菌牛乳中發(fā)現(xiàn)5-HMF為2.49μmol/L，在UHT牛乳中，乳糖含量為120和250 mg/L時(shí)，5-HMF含量為5.6和8.7μmol/L。而本實(shí)驗(yàn)中，在鮮羊乳和鮮駱駝乳中未檢測(cè)到5-HMF。如圖2所示，巴氏羊乳、超巴氏羊乳和UHT羊乳中5-HMF含量分別為0.32、0.67和1.31 mg/100 g蛋白質(zhì)，而巴氏駱駝乳、超巴氏駱駝乳和UHT駱駝乳中5-HMF含量分別為0、0.96和1.79 mg/100 g蛋白質(zhì)。巴氏羊乳中5-HMF的含量高于巴氏駱駝乳中5-HMF的含量，但是經(jīng)過超巴氏和UHT熱處理后的羊乳樣品中5-HMF含量明顯低于熱處理駱駝乳樣品。生駝乳和巴氏殺菌駝乳中未檢測(cè)到5-HMF，而在超巴氏殺菌駝乳和UHT駝乳中檢測(cè)到5-HMF，可能是由于5-HMF可以通過賴氨酸和乳糖之間的美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，但是也可以在沒有賴氨酸的情況下，通過溫度的升高（>100℃）導(dǎo)致乳糖的異構(gòu)化和降解產(chǎn)生。
圖2 不同熱處理羊乳和駱駝乳中5-HMF含量的變化
5-HMF含量與FRS含量增長(zhǎng)趨勢(shì)可反映美拉德反應(yīng)中占主要進(jìn)程的特定反應(yīng)階段。高萌同樣發(fā)現(xiàn)，隨熱處理溫度增高和時(shí)間增長(zhǎng)，巴氏殺菌牛乳和UHT牛乳中5-HMF含量均發(fā)生了明顯變化，熱處理溫度越高和熱處理時(shí)間越長(zhǎng)，導(dǎo)致牛乳中5-HMF含量越高。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鮮羊乳和鮮駱駝乳進(jìn)行UHT處理時(shí)，美拉德反應(yīng)第1、第2階段的同時(shí)劇烈進(jìn)行，進(jìn)而導(dǎo)致FRS和5-HMF的含量均激增。
2.3 不同處理乳樣品中電子鼻的結(jié)果分析
由圖3可知，圖（a）和圖（b）第一主成分和第二主成分的總貢獻(xiàn)率分別為98.61%和98.80%，幾乎包含了大部分的樣本信息，可有效地表達(dá)各樣品間的差異性。圖3中的橢圓代表每個(gè)樣品的整體信息特征，圖形的距離代表樣品之間氣味的差異；表格中黑色數(shù)值代表有顯著性差異，綠色數(shù)值代表有極顯著性差異。從圖3(a）中可以看出巴氏殺菌羊乳與超巴氏殺菌羊乳氣味較類似，與UHT乳、鮮羊乳樣品氣味差異較大，這可能是由于鮮乳的UHT處理會(huì)導(dǎo)致乳中蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類以及其他化合物的揮發(fā)性化合物的形成。在圖3(b）中可以看出，不同熱處理的駱駝乳樣品間有顯著差異，其中巴氏殺菌駱駝乳與超巴氏殺菌駱駝乳氣味較類似，與UHT駱駝乳樣品氣味差異較大，可能是由于高溫處理使乳中形成了大量的酮類物質(zhì)，進(jìn)而造成風(fēng)味的顯著差異，而溫度的高低和時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)新物質(zhì)形成及其含量的大小起了至關(guān)重要的作用，所以，在PCA圖中可觀察到樣品風(fēng)味存在明顯差異。在圖3中，隨著熱處理程度的增加，羊乳和駱駝乳樣品的PCA圖呈逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)，由此可推測(cè)其他熱處理羊乳和駱駝乳樣品的PCA圖，為電子鼻數(shù)據(jù)提供理論依據(jù)。
圖3 不同熱處理樣品電子鼻PCA圖
2.4 不同處理乳樣品中電子舌的結(jié)果分析
乳中因?yàn)楹胸S富的乳糖、蛋白質(zhì)、脂肪以及一些無機(jī)鹽如鈉鹽和鈣鹽等，在加熱過程中蛋白質(zhì)之間互相作用，蛋白質(zhì)分解為肽段和氨基酸，與乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，與無機(jī)鹽發(fā)生螯合作用等都會(huì)對(duì)乳的滋味產(chǎn)生很大的影響。在本實(shí)驗(yàn)中，電子舌配備的5個(gè)傳感器可以分別對(duì)酸、咸、鮮、甜和苦這5種滋味作出評(píng)價(jià)，但是由于甜和苦這兩種滋味的呈味物質(zhì)較為復(fù)雜，因此儀器不能進(jìn)行具體評(píng)價(jià)。如圖4所示，利用電子舌傳感器對(duì)不同處理?xiàng)l件下駱駝乳和羊乳中酸、咸和鮮味的味感值進(jìn)行測(cè)定，其中UHT羊乳的鮮味最大和咸的味感值最小，超巴氏羊乳的酸味和咸味的味感值最大；鮮駱駝乳的酸味和鮮味的味感值最大且咸味最小，巴氏駱駝乳和UHT駱駝乳的味感值較接近。從圖4(a）中可以看出，與鮮羊乳相比，超巴氏羊乳與UHT羊乳的味感值變化較為明顯。而從圖4(b）可以看出，與鮮駱駝乳相比，巴氏駱駝乳、超巴氏駱駝乳和UHT駱駝乳中酸味和鮮味的味感值變化較為明顯，導(dǎo)致滋味發(fā)生改變的可能原因是在加熱過程中蛋白質(zhì)與乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，對(duì)鮮乳的滋味產(chǎn)生較大改變，此外，熱處理后脂肪的水解會(huì)影響鮮乳的酸味，鈉鹽和鈣鹽會(huì)在咸味方面發(fā)揮一定作用。電子舌檢測(cè)時(shí)獲取的信息是來自于乳制品中的所有物質(zhì)(包括揮發(fā)性，半揮發(fā)性和難揮發(fā)性物質(zhì)等)；雖然電子鼻的操作過程較電子舌更為簡(jiǎn)便，操作時(shí)間更短，但是電子鼻檢測(cè)時(shí)獲取的樣品信息主要來自于奶制品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)，因此電子舌較電子鼻能更完整獲取樣品信息，得到更精確的結(jié)果。為了達(dá)到盡可能在短時(shí)間內(nèi)將樣品精確的區(qū)分的目的，可以將電子鼻和電子舌的結(jié)合以此來解決問題。
圖4 不同熱處理樣品電子舌雷達(dá)圖
2.5 不同溫度和時(shí)間處理駱駝乳和羊乳樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律
結(jié)果見圖5。
圖5 不同熱處理樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)熱圖
由圖5可見，通過GC-MS和GC-IMS分別檢測(cè)不同熱處理?xiàng)l件下駱駝乳和羊乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)并結(jié)合聚類分析和歸一化處理得到的熱圖。從圖5(a）可以看出，與鮮羊乳相比，經(jīng)過熱處理后的樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在組成和含量上發(fā)生了較大變化，尤其是UHT羊乳。隨著熱處理強(qiáng)度的增加，酸類（壬酸、癸酸和辛酸等）和酯類物質(zhì)（乙酸己酯和異戊酸異戊酯）的含量減少，酮類（2-壬酮和2-甲基-3-辛酮）和醇類物質(zhì)（糠醇、異辛醇和正己醇）的含量增加。有文獻(xiàn)報(bào)道，羊乳中辛酸、壬酸和癸酸等酸類物質(zhì)可以產(chǎn)生膻味，而在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)熱處理的羊乳中該類物質(zhì)相對(duì)含量減少，說明熱處理在一定程度上可以降低羊乳的膻味。在巴氏殺菌羊乳和超巴氏殺菌羊乳樣品中，揮發(fā)性化合物的類型相似，但由于加熱強(qiáng)度不同，風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量也不同，與電子鼻的結(jié)果一致。從圖5(b）可以看出，在鮮駱駝乳樣品中檢測(cè)到苯乙醛、丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、3-羥基-2-丁酮和異戊醇，駝乳中的醛類和酮類在加熱前后變化很大。在羊乳樣品中檢測(cè)出酸類物質(zhì)和烷類物質(zhì)，而駱駝乳樣品中并未檢測(cè)到。醛類、酮類和有機(jī)酸是美拉德反應(yīng)的主要產(chǎn)物。
乳中風(fēng)味的形成除了自身形成的風(fēng)味外，在加工階段中原料乳的一些酶發(fā)生了酶促反應(yīng)，從而形成了獨(dú)特的風(fēng)味。在熱處理過程中，乳中風(fēng)味變化的關(guān)鍵與美拉德反應(yīng)、脂質(zhì)降解過程中乳脂蛋白、乳清蛋白和乳脂小球膜中其他蛋白質(zhì)的熱變性有關(guān)。隨著科技的發(fā)展與檢測(cè)技術(shù)的提升，SPME-GC-MS的檢測(cè)方法為樣品中風(fēng)味物質(zhì)的分離和鑒別提供了很大的幫助，可以較大程度地分離和鑒別乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。何靜等利用GC-MS技術(shù)鑒定出醇類、醛類、酮類、酯類是駱駝乳中主要風(fēng)味物質(zhì)，不同的加熱方式處理的駱駝乳主要的揮發(fā)性成分差異顯著,尤其UHT處理后駝乳中的烷烴類化合物較多。依勝男等運(yùn)用SPME-GC-MS技術(shù)鑒定不同熱處理牛乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)熱處理強(qiáng)度越大，風(fēng)味物質(zhì)種類增加越多，其中醛類、酮類和酯類相對(duì)含量增加明顯，部分酸類相對(duì)含量明顯減少。
3 結(jié)論
本研究對(duì)不同熱處理的羊乳和駱駝乳中美拉德產(chǎn)物和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行比較，證實(shí)了熱處理會(huì)使羊乳和駱駝乳中美拉德產(chǎn)物含量增加，也會(huì)使揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生變化。其中鮮羊乳、巴氏殺菌羊乳、超巴氏殺菌羊乳和UHT羊乳中FRS的含量隨著熱處理強(qiáng)度的增加逐漸增加，分別是駝乳的0、1.15、2.02和2.49倍；鮮駝乳、巴氏殺菌駝乳、超巴氏殺菌駝乳和UHT駝乳中5-HMF的含量隨著熱處理強(qiáng)度的增加逐漸增加，分別是羊乳的0、0、1.43和1.37倍。電子鼻和電子舌測(cè)定的羊乳和駱駝乳中氣味和滋味差異顯著，但是氣味和滋味之間也存在一定的相關(guān)性。通過GC-MS和GC-IMS測(cè)定不同熱處理?xiàng)l件下羊乳和駱駝乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中UHT羊乳中風(fēng)味物質(zhì)與其他羊乳樣品間差異極其顯著，而鮮駝乳中風(fēng)味物質(zhì)與其他熱處理駝乳樣品差異極其顯著。由此可見，不同的熱處理方式對(duì)羊乳和駱駝乳的風(fēng)味品質(zhì)有不同的影響。因此，在滿足產(chǎn)品工藝和殺菌要求的情況下，盡可能的提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和活性物質(zhì)水平、降低美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成、改善產(chǎn)品風(fēng)味。
