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牛奶營養(yǎng)成分豐富，是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾臓I養(yǎng)來源之一。為消滅牛奶中對人體有害的微生物和酶，工業(yè)生產(chǎn)中會對牛奶進(jìn)行熱處理,而牛奶中的乳清蛋白經(jīng)熱處理后極易發(fā)生變性，使其活性蛋白喪失活性。巴氏殺菌和超高溫瞬時滅菌(UHT)仍是國內(nèi)外目前乳制品熱處理的主要方式,隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的不斷發(fā)展，蒸汽侵入式直接殺菌(INF)技術(shù)成為目前國際上一種先進(jìn)的牛奶殺菌方式，該技術(shù)將牛乳在159℃、0.09 s條件下瞬時加熱，采用此技術(shù)制備牛奶，對蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的破壞度小，營養(yǎng)成分保留更高，口感更新鮮。美拉德反應(yīng)是液態(tài)乳殺菌過程中的重要反應(yīng)之一，其產(chǎn)物會對乳品質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。美拉德反應(yīng)的兩個產(chǎn)物糠氨酸和羥甲基糠醛(HMF),分別是作為反應(yīng)指示物的初始產(chǎn)物，以及作為反應(yīng)進(jìn)行程度評價指標(biāo)的中間產(chǎn)物。乳果糖可鑒別不同熱處理牛乳，目前國際上通常用糠氨酸和乳果糖作為評估熱處理對奶制品質(zhì)量影響的指標(biāo)。本研究通過對INF殺菌乳及其他3種常見熱處理滅菌乳的研究，分析不同熱處理方式對牛奶乳清蛋白的影響，包括活性蛋白組成、含量及微觀結(jié)構(gòu)的改變，從而提高消費者對熱處理滅菌乳的認(rèn)識，改變消費理念，這也與我國目前提倡的“國家優(yōu)質(zhì)乳工程”相契合。

LC-20AD型高效液相色譜儀；pH計(精度0.1);離心機(轉(zhuǎn)速≥10 000 r/min);ME204分析天平;1600PC紫外-可見分光光度計；S-3400N掃描電子顯微鏡(SEM),HITACHI;IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀，SHIMADZU;日立F-2700熒光光譜分析儀；Zetasizer Nano S90納米粒度測定儀，Malvern; FW-4A 粉末壓片機；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱。

磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甘氨酸、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙酸銨、辛醇、過氧化氫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、硫酸銨、硫酸鎂(均為分析純);冰醋酸(優(yōu)級純，室溫保存)、三氟乙酸(色譜純，99.9%,4℃保存)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、肝素親和柱(4℃冰箱內(nèi)儲存)。

奶場牛乳：當(dāng)天采集，不進(jìn)行任何熱處理；巴氏殺菌乳：取奶場牛乳于65℃的水浴鍋中加熱30 min; INF殺菌乳：取奶場牛乳在157℃的條件下加熱0.09 s; UHT滅菌乳：取奶場牛乳于137℃下加熱處理4 s。

將1.3中的4種熱處理牛奶樣品進(jìn)行離心脫脂，離心條件為4℃、10 000 r/min離心10 min, 棄去上層脂肪后得到脫脂乳。利用酸等電點沉淀離心法制備乳清蛋白：用1 mol/L HCL將脫脂乳的pH調(diào)至4.6,于4℃、5 000 r/min離心20 min,取上清液密封置于-20℃冰箱內(nèi)待測。

精確稱取各樣品20 g(精確到0.001 g)置于50 mL容量瓶中，加入適量pH為6.5的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(流動相A),超聲提取20 min, 冷卻至室溫后用pH為2.5的甘氨酸鹽酸緩沖液(流動相B)定容，搖勻后將樣品移至離心管4℃ 10 000 r/min離心10 min。取過濾液2.5 mL,通過Pharmacia HI-Trap Protein G柱凈化后定容至1.5 mL,液相色譜分析。采用色譜柱CAPCELL PAK C18(4.6m mL.D.×250 mm, 5 μm)等度洗脫，流動相為乙腈：0.1%三氟乙酸=6:4,流速為1 mL/min, 進(jìn)樣體積為20 μL,在紫外280 nm下進(jìn)行檢測。

參考河北省奶業(yè)協(xié)會發(fā)布的《活性蛋白牛乳(牛)》中的方法對4種牛奶中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進(jìn)行測定。取1.4中制備的4種乳清蛋白各1 mL稀釋10倍后，過0.22 μm濾膜，上機待測。采用色譜柱：BEH300 C4(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 300 ?),進(jìn)行梯度洗脫分離。流動相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液、流動相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈，流速為0.3 mL/min, 進(jìn)樣體積為10 μL,在紫外280 nm下檢測。

(1)配制由84 mmol/L Na2HPO4和16 mmol/L NaH2PO4制成的結(jié)合緩沖液。(2)精確稱取5 g牛奶樣品于100 mL三角瓶中，加入30 mL結(jié)合緩沖液渦旋振蕩1 min后移至50 mL容量瓶，加入結(jié)合緩沖液定容；(3)將樣本移至離心管，離心條件為4℃、12 000 r/min、10 min, 使用移液器輕輕吸出10～30 mL中間液作為樣品提取液；(4)配制由42 mmol/L NaH2PO4、8 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L NaCl制成的淋洗液以及由42 mmol/L NaH2PO4、8 mmol/L NaH2PO4、1 mol/L NaCl制成的洗脫液；(5)加5 mL結(jié)合緩沖溶液于肝素親和柱內(nèi)進(jìn)行平衡，加樣品提取液，待其完全流出后，加入10 mL淋洗液，并棄去全部流出液，再加入2.5 mL洗脫液，收集全部流出液，并定容至3.5 mL,過濾膜供液相色譜檢測用。(6)采用色譜柱：BEH300 C4(Waters, 100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 300 ?)進(jìn)行梯度洗脫。流動相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液、流動相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈，流速為0.45 mL/min, 進(jìn)樣體積為10 μL,在紫外280 nm下檢測。

參考NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》測定糠氨酸含量。吸取1.3中4種不同熱處理的牛奶各2 mL和10.6 mol/L鹽酸溶液6 mL一同加入密閉耐熱試管中，混勻后將試管置于干燥箱，110℃下加熱水解12 h以上，加熱結(jié)束后，冷卻過濾，濾液為水解液。吸取1 mL水解液于試管中，加入6 g/L乙酸銨溶液5 mL,混勻后過0.22 μm水相濾膜，濾液上機測定。采用色譜柱：C18硅膠色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)梯度洗脫、流動相A為0.1%三氟乙酸溶液、流動相B為甲醇，流速為1 mL/min, 進(jìn)樣體積為10 μL,在紫外280 nm下檢測。

采用Ellman’s 5,5’-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸，DTNB)法測定不同熱處理后乳清蛋白溶液的表面巰基含量。稱取適量樣品，溶于蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，吸取1 mL蛋白溶液，加入4.0 mL Tris-甘氨酸緩沖液I和50 μL Ellman’s試劑，混合均勻后于37℃恒溫培養(yǎng)15 min; 并于412 nm波長下測定吸光度。

參考NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》測定乳果糖含量。

室溫下采用Malvern納米粒度測定儀進(jìn)行粒徑分布的測定。將4種乳清蛋白樣品用去離子水稀釋5倍，調(diào)整顆粒折射率為1.59,分散劑折射率為1.33,分散劑吸收率為0.887 2。

將4種乳清蛋白溶液用去離子水稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，設(shè)置激發(fā)波長為290 nm, 在此波長下進(jìn)行發(fā)射波長的掃描，掃描光譜范圍為300～450 nm, 掃描速度為60 nm/min, 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

取1.4中4種熱處理牛奶乳清蛋白各5 mL樣品平鋪于培養(yǎng)皿中，冷凍干燥48 h制成凍干粉。用稱量勺挑取少量凍干粉樣品置于粘有雙面膠的樣品臺上，用洗耳球吹去附著的和未固定牢的樣品，噴金120 s后用掃描電鏡觀察。

采用傅里葉變換紅外光譜儀測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。準(zhǔn)確稱取1.5 mg 1.8.3中的凍干粉樣品置于瑪瑙研缽中，再稱取150 mg干燥的溴化鉀(樣品：溴化鉀=1:100),研磨均勻后用壓片機制成供試片備用。測定時將供試片置于紅外光譜儀的樣品光路中，設(shè)置分辨率為4 cm-1,在波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描，掃描次數(shù)為32次，利用Origin 2021對紅外光譜進(jìn)行分峰擬合計算。

如圖1可知，奶場樣品中乳清活性蛋白總量在4種不同熱處理樣品中最高，其中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白含量均為最高，分別為1 413.3 、4 024.4 mg/L。UHT滅菌乳中乳清活性蛋白總量最低，其中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白含量均為最低，分別為116.2、378.9 mg/L,且乳鐵蛋白和免疫球蛋白基本沒有檢出。INF殺菌乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白的含量與巴氏殺菌乳相當(dāng)，但免疫球蛋白含量低于巴氏殺菌乳。從4種不同熱處理牛奶中乳清活性蛋白的含量可以看出，隨著熱處理溫度的升高和時間的增加，乳清蛋白中活性蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢。

由表1可知，奶場樣品中乳果糖和糠氨酸含量均為最低，分別為7.25 、3.65 mg/100 g; 巴氏殺菌乳和INF殺菌乳中兩者含量基本相當(dāng)；UHT滅菌乳中兩者含量均為最高，分別為13.97 、166.3 mg/100 g, 其中糠氨酸含量是其他熱處理牛奶的10倍以上。Leen Mortier等對比利時市場上的各種奶類共154個奶樣進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UHT滅菌乳中的平均乳果糖和糠氨酸含量是巴氏殺菌乳中的10倍以上，具有顯著性差異，這也與本實驗的結(jié)果一致。由圖2可知，UHT滅菌乳中表面巰基含量最高，為52.7 μmol/L,奶場樣品中含量最低，為17.5 μmol/L,巴氏殺菌乳和INF殺菌乳中表面巰基含量相當(dāng)，分別為27.8 、32.9 μmol/L。牛乳中約90%的巰基位于β-乳球蛋白上，每個β-乳球蛋白單體均含有1個游離巰基及2個二硫鍵，β-乳球蛋白隨著熱處理溫度的升高以及加熱時間的增加，發(fā)生熱變性，從而使其分子鏈展開，將其巰基暴露出來，故表面巰基的含量逐漸增加。

由圖3可知，4種不同熱處理的牛奶樣品中，UHT滅菌乳的乳清蛋白平均粒徑最大，其次是INF殺菌乳，巴氏殺菌乳和奶場樣品的乳清蛋白平均粒徑大小相當(dāng)。粒徑是影響牛奶穩(wěn)定性的重要因素之一，不同熱處理方式牛奶中的乳清蛋白會發(fā)生不同程度的變性，導(dǎo)致蛋白的平均粒徑發(fā)生變化，這可能是因為乳清蛋白分子之間生成凝聚物。

由表2可知，本試驗中4種不同熱處理牛奶的乳清蛋白最大熒光強度均>330 nm, 由Halder U C等的研究可知，最大熒光強度值反映色氨酸殘基的微環(huán)境，當(dāng)色氨酸殘基處于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中時，最大熒光強度值>330 nm, 故本實驗4種熱處理牛奶的乳清蛋白均處于極性環(huán)境中。與奶場樣品相比，巴氏殺菌乳和INF殺菌乳的最大熒光強度值無明顯變化，而UHT滅菌乳的乳清蛋白最大熒光強度大于其他3種熱處理奶樣，可能是因為UHT滅菌乳經(jīng)高溫較長時間熱處理后，導(dǎo)致維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的疏水相互作用被破壞，蛋白的極性環(huán)境增加。3種熱處理牛奶相較奶場樣品其乳清蛋白熒光強度均有降低，雖然INF殺菌乳熱處理溫度最高，但其加熱時間不足1 s, 明顯小于UHT滅菌乳的加熱時間，故UHT滅菌乳蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，其熒光強度降低最為顯著。

圖4為4種不同熱處理牛奶乳清蛋白的掃描電鏡圖，其中圖A為未經(jīng)熱處理的奶場樣品，可以看出其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)大小比較均勻，表面比較光滑。與圖A相比，圖B到圖D開始呈現(xiàn)更不規(guī)則且無序的結(jié)構(gòu)，其中UHT殺菌乳的乳清蛋白結(jié)構(gòu)明顯增大且有片層出現(xiàn)，這可能是因為高溫較長時間的加熱可以破壞蛋白質(zhì)非共價力，導(dǎo)致多層聚集體和大聚集體的形成。對大豆蛋白進(jìn)行干熱處理，掃描電鏡結(jié)果也顯示樣品呈現(xiàn)出多層片狀的破碎結(jié)構(gòu)。

參考相關(guān)文獻(xiàn)可知，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，1 645～1 658 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 665～1 680 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在1 640～1 644 cm-1和1 681～1 690 cm-1,無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在1 659～1 664 cm-1。采用Omnic 8.2軟件得到4種不同熱處理牛乳乳清蛋白的紅外光譜分析圖，再用PeakFit 4.2計算各二級結(jié)構(gòu)含量。由圖5可知，隨著熱處理溫度的升高，1 600～1 700 cm-1間子峰的強度發(fā)生改變，說明4種不同熱處理牛奶的乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。結(jié)合表3可得，奶場樣品的α-螺旋結(jié)構(gòu)最多，為39.06%,經(jīng)過UHT滅菌后，其含量降低至13.81%,隨著溫度和熱處理時間的增加，α-螺旋有著明顯降低的趨勢。巴氏殺菌乳和INF殺菌乳的二級結(jié)構(gòu)組成基本相當(dāng)。從表3還可以看到，無規(guī)則卷曲在奶場樣品中最低為7.02%,在UHT滅菌乳中組成最高，為29.61%。蛋白質(zhì)分子外部環(huán)境變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變，使其發(fā)生構(gòu)象改變和折疊。α-螺旋是最常見也是最穩(wěn)定的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，隨著熱處理溫度的升高，α-螺旋的逐漸減少可能是由于蛋白熱變性導(dǎo)致α-螺旋氫鍵斷裂，發(fā)生解螺旋。無規(guī)則卷曲的增多表明，乳清蛋白結(jié)構(gòu)的隨機性隨熱處理增強，使有序結(jié)構(gòu)逐漸向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。

本試驗通過對4種不同熱處理牛奶的乳清蛋白含量、微觀結(jié)構(gòu)及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量等方面進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)奶場牛奶乳清活性蛋白總量最高，UHT滅菌乳含量最低。INF殺菌乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白的含量與巴氏殺菌乳相當(dāng)。(2)UHT滅菌乳中糠氨酸和乳清蛋白溶液表面巰基含量均明顯高于其他3種熱處理奶樣，乳果糖含量略高于其他3種奶樣。INF殺菌乳中乳果糖、糠氨酸及表面巰基含量均與巴氏殺菌乳相當(dāng)。(3)4種熱處理牛奶中，巴氏殺菌乳、INF殺菌乳及UHT滅菌乳的粒徑大小較奶場樣品有不同程度的增加，其中UHT滅菌乳的增加最為顯著；UHT滅菌乳中乳清蛋白極性環(huán)境的增加大于其他3種熱處理牛奶。(4)隨著熱處理時間和溫度的增加，4種牛奶乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋逐漸減少，無規(guī)則卷曲逐漸增加，乳清蛋白結(jié)構(gòu)從有序向無序轉(zhuǎn)化。INF殺菌乳和巴氏殺菌乳的變性趨勢基本一致，優(yōu)于UHT滅菌乳。